Principios de la extinción de fluorescencia (QF)

La extinción de fluorescencia es un proceso fotofísico esencial que desempeña un papel crucial en la espectroscopía moderna, la tecnología de medición y el análisis molecular. Se ha convertido en una herramienta esencial para la medición de oxígeno en tiempo real en el procesamiento de gas natural, el bioprocesamiento, la monitorización medioambiental y el diagnóstico médico. Su atractivo radica en la precisión, selectividad y estabilidad que ofrece sin necesidad de utilizar piezas móviles, consumibles químicos ni la sensibilidad cruzada propia de los sensores tradicionales.

En este artículo se exploran los fundamentos físicos de la extinción de fluorescencia, sus técnicas de detección y sus múltiples aplicaciones, y se comparan con otros enfoques ópticos y electroquímicos empleados en la medición de gases.

Cuando una molécula absorbe energía luminosa, sus electrones se elevan a un nivel energético superior, en un proceso denominado excitación. Al volver a su estado básico, la molécula libera parte de la energía absorbida en forma de luz visible o casi visible. Esta luz reemitida se denomina fluorescencia.

La fluorescencia solo se produce en moléculas con estructuras electrónicas específicas, a menudo tintes orgánicos o complejos de metales de transición. La luz emitida suele presentar una longitud de onda mayor —y, por tanto, menor energía— que la luz absorbida, debido a la pérdida interna de energía durante el proceso de relajación. La diferencia entre las longitudes de onda absorbidas y emitidas se conoce como desplazamiento de Stokes, un principio esencial en la detección basada en fluorescencia.

La extinción de fluorescencia ocurre cuando un agente externo modifica la molécula fluorescente, alterando la luz que emite tras la excitación. El “supresor de fluororescencia” —habitualmente otra molécula— interactúa con el estado excitado del fluoróforo, facilitando la pérdida de energía por vías no radiativas, como colisiones o transferencia de energía, en lugar de la emisión de un fotón.

Existen varios mecanismos de extinción de fluorescencia, como, por ejemplo:

• Extinción dinámica (por colisión): la energía del fluoróforo en estado excitado se transfiere al supresor de fluorescencia durante colisiones moleculares.
• Extinción estática: se forma un complejo no fluorescente entre el fluoróforo y el supresor de fluorescencia antes de que se produzca la excitación.
• Transferencia de energía y de electrones: la energía o los electrones se intercambian entre especies, lo cual provoca una disminución del rendimiento de fluorescencia.

En muchas aplicaciones industriales de detección, el oxígeno (O₂) actúa como supresor de fluorescencia. Dado que el oxígeno desactiva de manera eficiente los estados excitados de ciertos colorantes, las variaciones en la intensidad o en el tiempo de vida de la fluorescencia pueden correlacionarse directamente con la concentración de oxígeno presente en el entorno.

La relación cuantitativa entre la extinción de fluorescencia y la concentración de agente supresor se expresa mediante la ecuación de Stern-Volmer:

I₀ / I = 1 +_KSV[Q]

O, de forma equivalente, utilizando el tiempo de vida de la fluorescencia:

τ₀ / τ = 1 +_KSV[Q]

Donde:

• I₀ y τ₀ corresponden a la intensidad de fluorescencia y el tiempo de vida sin supresor de fluorescencia.
• I y τ son los valores correspondientes en presencia del supresor de fluorescencia.
• K_SV es la constante de enfriamiento de Stern-Volmer.
• [Q] es la concentración del inhibidor de la fluorescencia.

Dado que esta relación es lineal, es posible establecer una detección cuantitativa. Al controlar los cambios en la intensidad o en el tiempo de vida de la fluorescencia, es posible determinar con precisión la concentración del agente supresor, como el oxígeno disuelto o gaseoso.

Los sensores ópticos de oxígeno se basan en el principio de que las moléculas de oxígeno pueden "suprimir/apagar" la fluorescencia de un colorante excitado. El proceso de medición suele seguir estos pasos:

1. Excitación: una fuente de luz, a menudo un LED azul (≈470 nm), ilumina un colorante fluorescente inmovilizado en una matriz permeable al oxígeno.
2. Emisión: en ausencia de oxígeno, el colorante emite fluorescencia de color rojo brillante o en el infrarrojo cercano.
3. Apagado/Supresión: cuando hay oxígeno, este choca con las moléculas excitadas del colorante y transfiere energía de forma no radiativa, disminuyendo la intensidad de la fluorescencia y provocando un desplazamiento en la longitud de onda emitida.
4. Detección: la luz emitida retorna a través de una fibra óptica hacia un fotodetector, donde se mide el desplazamiento de fase.
5. Cálculo: el sistema calcula la concentración de oxígeno utilizando constantes de calibración derivadas de la relación Stern-Volmer.

Este ciclo permite medir el oxígeno en tiempo real, sin consumirlo y con una sensibilidad notable, desde niveles de partes por millón (ppm) hasta concentraciones porcentuales.

Existen dos técnicas principales para cuantificar la extinción de fluorescencia: la detección basada en la intensidad y la detección basada en el tiempo de vida o en el desplazamiento de fase.

• Detección basada en la intensidad: en los primeros sensores ópticos de oxígeno, la concentración de oxígeno se infería a partir de la disminución de la intensidad de fluorescencia comparándolo con un valor de referencia. Sin embargo, este método resulta algo sensible a las variaciones de la fuente de luz, al envejecimiento del tinte y a la alineación del sistema óptico.
• Detección basada en el tiempo de vida o en el desplazamiento de fase: los sensores modernos de extinción de fluorescencia utilizan fuentes de luz moduladas en fase para medir el retardo temporal (desplazamiento de fase) entre la luz de excitación y la fluorescencia emitida. Dado que la vida útil de la fluorescencia es una propiedad molecular intrínseca, este método se ve mucho menos afectado por las condiciones ambientales o los cambios en la intensidad de la luz.

El tiempo de vida de la fluorescencia generalmente disminuye de microsegundos a nanosegundos a medida que aumenta la concentración de oxígeno. Este enfoque basado en el desplazamiento de fase permite tiempos de respuesta rápidos, estabilidad a largo plazo y alta inmunidad a las desviaciones, ventajas clave en aplicaciones industriales.

La extinción de la fluorescencia consiste básicamente en un proceso de transferencia de energía mediante colisiones entre fluoróforos excitados y moléculas atenuadoras. En el caso de la extinción por oxígeno, esta interacción se rige por la cinética de difusión y el solapamiento de los orbitales moleculares.

La eficiencia de la extinción depende de factores como:

• Velocidad de difusión del oxígeno a través de la matriz del sensor
• Temperatura (afecta a la difusión y a la frecuencia de colisión)
• Viscosidad y estructura del material huésped
• Tiempo de vida en estado excitado del fluoróforo

Adaptando la composición y la porosidad de la película polimérica, los ingenieros pueden controlar la velocidad de difusión del oxígeno y optimizar el tiempo de respuesta y la sensibilidad del sensor.

Un sensor de oxígeno de extinción de fluorescencia consta de tres componentes principales:

• Capa de sensor fluorescente (matriz de colorante): una película de polímero sólido o sol-gel dopada con un colorante sensible al oxígeno (como un complejo de rutenio o platino); el colorante se selecciona por su fotoestabilidad y sus características de extinción específicas
• Fibra óptica o ventana: transporta la luz de excitación desde la fuente hasta la punta del sensor y retorna la fluorescencia emitida al detector; el uso de fibras ópticas permite una detección no invasiva y a distancia
• Módulo de detección y electrónica: contiene la fuente de luz, el fotodiodo o fotomultiplicador y la electrónica de procesamiento de señales para determinar los cambios de fase o intensidad

Estos componentes suelen integrarse en robustos diseños de sensores industriales para ser empleados en líneas de gas de proceso, sondas medioambientales o biorreactores. Sin embargo, el principio básico de medición sigue siendo el mismo.

La adopción de los sistemas de extinción de fluorescencia en las mediciones industriales se ve favorecida por su simplicidad óptica y su robustez química en comparación con las tecnologías tradicionales. La extinción de fluorescencia presenta diversas ventajas, como, por ejemplo:

• Selectividad para el oxígeno: la extinción de fluorescencia es selectiva al oxígeno y, además, presenta una sensibilidad cruzada insignificante al vapor de agua, sulfuro de hidrógeno o dióxido de carbono, especies que suelen interferir con los sensores electroquímicos.
• Concentraciones de partes por millón (ppm )
• Estabilidad a largo plazo: los sistemas ópticos no contienen reactivos consumibles ni electrolitos. Gracias a matrices de colorantes estables y componentes de estado sólido, los intervalos de calibración son prolongados y el mantenimiento, mínimo.
• Medición rápida y continua: Dado que la extinción es un proceso de colisiones instantáneo, los sensores de fluorescencia responden en milisegundos a los cambios en la concentración de oxígeno. De esta forma es posible monitorizar en tiempo real los procesos dinámicos.
• Seguridad y compatibilidad: dado que estos sensores funcionan ópticamente y sin contacto de la muestra con elementos reactivos, pueden medir con seguridad el oxígeno en corrientes de hidrocarburos, gases inflamables o medios biológicos sin riesgo de ignición o contaminación.

Para analizar el oxígeno también se emplean otras tecnologías, cada una de las cuales presenta ciertas ventajas y limitaciones. Comparándolas es posible entender en qué situaciones la extinción de fluorescencia resulta más útil.

• Principio de funcionamiento: detección óptica de la extinción de la fluorescencia provocada por la colisión con el colorante excitado
• Intervalo habitual de uso: ppm - %
• Ventajas: es una técnica rápida, selectiva, no precisa consumibles y presenta pocas desviaciones
• Limitaciones: el coste inicial del sensor es relativamente superior

• Principio de funcionamiento: mide la presión parcial de oxígeno mediante una reacción electroquímica en un electrolito sólido de circonio a alta temperatura.
• Intervalo habitual de uso: %
• Ventajas: alta precisión a temperaturas elevadas; robustez en entornos industriales difíciles
• Limitaciones: requiere un elemento calefactor; ofrece una respuesta más lenta a bajas temperaturas; está limitado al rango de %

• Principio de funcionamiento: la reacción química entre el oxígeno y los electrodos en el electrolito genera una corriente
• Intervalo habitual de uso: ppm - %
• Ventajas: bajo coste, electrónica sencilla
• Limitaciones: requiere la sustitución periódica de las celdas; es sensible al H₂S y a la humedad

• Principio de funcionamiento: el oxígeno es atraído por un campo magnético; se mide el par magnético
• Intervalo habitual de uso: %
• Ventajas: elevada precisión a altas concentraciones
• Limitaciones: no es adecuado para flujos de H₂S o hidrocarburos; está limitado al intervalo de %

• Principio de funcionamiento: separación y detección de oxígeno mediante un gas portador y una columna
• Intervalo habitual de uso: ppm - %
• Ventajas: alta precisión analítica
• Limitaciones: es una técnica lenta (necesita unos minutos por cada muestra), presenta un coste elevado de mantenimiento

• Principio de funcionamiento: láser de diodo sintonizable a una longitud de onda específica en la que el oxígeno absorbe la luz
• Intervalo habitual de uso: %
• Ventajas: medición óptica sin contacto; puede utilizarse para mediciones in situ o extractivas
• Limitaciones: puede tener interferencias con otros gases de fondo; el polvo y los aerosoles pueden recubrir espejos y ventanas

En comparación con otros métodos de medición de oxígeno, la extinción de fluorescencia ofrece una combinación única de velocidad, estabilidad y resistencia en entornos químicamente agresivos o con una elevada humedad.

Tanto la difusión de oxígeno a través de la capa del sensor como la vida útil de fluorescencia del colorante dependen de la temperatura. Por ello, la mayoría de los sistemas incluyen una compensación automática de la temperatura, a menudo mediante un termistor situado en el mismo lugar. En las mediciones en fase gaseosa también puede ser necesario compensar la presión.

A lo largo de los años de funcionamiento, las películas de los sensores pueden experimentar un fotoblanqueamiento gradual del colorante o suciedad en la superficie. Sin embargo, con los materiales modernos, es habitual que la vida útil de los sensores supere los tres o cinco años.

La calibración suele implicar la exposición del sensor a concentraciones conocidas de oxígeno (por ejemplo, de nitrógeno para obtener el cero y aire para establecer el intervalo). Gracias a su estabilidad, los sensores basados en fluorescencia necesitan recalibrarse con menor frecuencia que las alternativas electroquímicas.

Nuevas matrices de sensores —como los híbridos de sol-gel, las nanopartículas de sílice y los polímeros fluorados— amplían el rango operativo y la tolerancia ambiental de los sensores de extinción de fluorescencia. Estos materiales mejoran la estabilidad del colorante y reducen el fotoblanqueamiento.

Los recientes avances en redes de fibra óptica y fotónica miniaturizada están haciendo posible la creación de sensores multiparamétricos que combinan la medición del oxígeno, el pH y la temperatura en una sola sonda.

En la investigación biológica y microfluídica, la microscopía de imágenes por tiempo de vida de fluorescencia (FLIM, por sus siglas en inglés) utiliza los mismos principios para generar mapas espaciales de oxígeno a escala microscópica, revelando gradientes críticos para el comportamiento celular y los procesos metabólicos.

• Procesamiento de gas natural - La entrada de oxígeno en los flujos de gas natural puede provocar corrosión, crear mezclas explosivas y degradar la calidad del producto. Los sensores de fluorescencia óptica proporcionan una medición continua y precisa del oxígeno desde la captación hasta la distribución, lo que ayuda a los operadores a mantener la integridad del sistema.
• Transición energética - En las aplicaciones de captura, utilización y almacenamiento de carbono (CCUS), el oxígeno es un contaminante que es necesario eliminar. Las aplicaciones de biogás/biometano se basan en la fermentación anaeróbica, por lo que es necesario medir el oxígeno para determinar si se producen fugas en el digestor. La calidad final del biometano también debe presentar niveles bajos de oxígeno, medidos en ppm. Las aplicaciones de hidrógeno verde también requieren la medición de oxígeno.
• Bioprocesamiento y fermentación - En biotecnología, controlar el oxígeno disuelto resulta vital para el metabolismo celular. Los sensores de fluorescencia se utilizan ampliamente en fermentadores para evitar los problemas de deriva y de esterilización que presentan las sondas electroquímicas.
• Medio ambiente y control del agua - La extinción por fluorescencia permite medir el oxígeno disuelto (OD) en aguas naturales y aguas residuales. Estos sensores proporcionan gran durabilidad y requieren poco mantenimiento, lo que los hace ideales para instalaciones a largo plazo.
• Medicina y ciencias de la vida - Desde la oxigenación de tejidos hasta sistemas microfluídicos, los sensores de fluorescencia permiten elaborar mapas ópticos no invasivos de oxígeno en pequeños volúmenes, esenciales para realizar estudios fisiológicos y farmacológicos.
• Aplicaciones aeroespaciales y sector energético - Inmunes a las interferencias electromagnéticas, los sistemas de extinción de fluorescencia en fibra se utilizan en pruebas aeroespaciales, la investigación en proceso de combustión y la monitorización de pilas de combustible, en los que la precisión y la velocidad de respuesta son fundamentales.

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